https://note.com/akaihiguma/n/nfd22bc2afa31
＜転載開始＞
サブスタックでも色々と工作があるのかな？🤔
この記事は、医療の箱庭洗脳に完全に浸かっり、盲目になっている人が明るくスッキリと視界を確保するきっかけになる可能性があるので、メモしておきます。
記事自体は少し難しい部分もありますが、じっくりと読んで理解できた時は、ウイルス学のゴールドスタンダードが詐欺であり、病原と伝われるウイルスは存在しない事実も自分の中に落とし込めることでしょう。
世界中の人々が1日でも早く自分と向き合い事実に気が付き、感染症詐欺を終わらせれる日が来るのを願っています。
ベロ細胞株
ジェイミー・アンドリュース
2025年9月27日
https://controlstudies.substack.com/p/controls2
最初にリリースされた実験については、Substackがシャドウバンしたか、結果のリーチを大幅に制限したようです。ほぼ1年間固定スレッドとして表示され、Twitterのスレッドでは50万回閲覧されているにもかかわらず、Substackは、この投稿は私がここに投稿した他のすべての記事と比べて50%未満しかパフォーマンスが低いと主張しています。
制限を回避するために、これらの最新の結果を再投稿/クロス投稿することをご検討いただけますでしょうか。どうぞよろしくお願いいたします。ジェイミー
プロトコルの作成、資金調達、実験管理を担ったAlbert .C. Mathews氏に謝辞を捧げます。本稿は、実験を実施した研究室技術者が記録した結果と観察結果に対する私の解釈です。利益相反はありませんでした。
抽象的な
この実験の目的は、Vero E6細胞株を用いて、SARS-CoV-2の細胞培養分離プロトコルの真のネガティブコントロールを実施、記録、および画像化することです。細胞培養はウイルス分離におけるゴールドスタンダードな手順であり、免疫学的および分子生物学的検査の較正基準として使用できる、新規ウイルス株分離株の特性評価を行う唯一の方法と考えられています。特性評価のための純粋かつ単離された生物学的粒子がなければ、このベンチマークに基づくその後のアッセイは無効となります。
欧州疾病予防管理センター（ ECDC）が規定するSARS-CoV-2分離プロトコル：SARS-CoV-2特性評価のための標準的な実験プロトコルでは、培養において、細胞株に栄養を与える培地を、標準的な10%ウシ胎児血清増殖培地から2%の飢餓培地に減らすことができることが示されています。私たちの予備実験では、このFBS濃度の低下が、感染していない培養物においてCPE形態を引き起こすこと、そしてCDCおよびNIHの透過型電子顕微鏡画像と相互参照可能な正確な粒子を生成することを包括的に実証しました。
実際には、記録されている限り、すべてのSARS-CoV-2分離株において、この感染培地をFBS濃度2%、あるいは1%まで減らすことが選択されています。これらの論文の一部でネガティブコントロールとして機能するとされている模擬感染株（実際にはほとんど実験を行っていない）では、使用した試薬とその濃度がほとんど記録されていません。したがって、これらの実験の目的は、これらの真のネガティブコントロールを実施し、SARS-CoV-2分離株で使用された試薬濃度の正確な変化を記録することです。
方法
図は実験手順を示しています。3つのステージ、2つの細胞培養経路、そして2つの培養培地があります。
詳細な手順
図に示すように、細胞は解凍され、「細胞株準備段階」に向けて継代培養されます。その後、「実験段階」では実験が2つのパスに分岐します。2つのパスで1回の継代培養が行われ、パス1では増殖培地1が、パス2では増殖培地2が使用されます。実験段階のこの継代培養中は培地交換は行われません。実験段階の後、「TEM準備段階」が始まり、細胞サンプルはTEMラボへの輸送に向けて準備されます。最後に、サンプルはTEMラボに送られ、画像化されます。
継代培養手順
デフォルトでは、継代培養はここにコピーした ATCC 推奨の手順に従うものとします。
図2. コピー継代手順
上記の手順は以下からコピーしたものです:
● REF2 > 製品詳細情報 > 取り扱い情報 > 継代手順
上記の手順に不足している詳細は、REF1の基本プロトコル2で補足してください。デフォルトの播種密度は、 REF3ごとに1～3×10,000細胞/cm2です。変更する場合は承認が必要です。
細胞株調製段階
REF1によれば、「凍結ストックからの回収後、Vero細胞は通常、通常の増殖速度に達するまでに2～3回の継代培養が必要です」。この段階は、この目標を達成するためのものです。デフォルトでは、この段階では、細胞解凍後の最初の継代培養について、ここに引用したATCC推奨の手順に従うものとします。
図3. 解凍手順のコピー
上記の手順は以下からコピーしたものです:
● REF2 > 製品詳細情報 > 取り扱い情報 > 取り扱い手順
上記の手順で不足している詳細は、REF1の基本プロトコル1で補完するものとする。目的達成に必要な以降の継代は、上記の継代培養手順に従うものとする。
実験段階
細胞培養は2つの経路に分割され、経路1では培地1、経路2では培地2が使用されました。実験段階では5日間にわたり、1回の継代培養が行われました。
TEM ステージ: 培養サンプルは次のように準備されました。
A. サンプルの固定:
1. 培地を捨て、すぐに 1.5% または 2.5% グルタルアルデヒド固定液 (pH 7.0) を加えて細胞を覆います。
2. 細胞をこすり取って遠心管に集めます。
3. 細胞を遠心分離し、上清を捨てます。
4. 培地と1:1で混ぜた固定液を加え、静かにペレット化します。
5. 室温（RT）で少なくとも1時間放置します。
6. 4°Cで保管し、保冷剤と一緒に発送します。
B. サンプルの準備:
1. 細胞を上記の固定液で室温で少なくとも2時間固定した。その後、0.1Mカコジル酸緩衝液で洗浄し、1%四酸化オスミウム（OsO4）/1.5%フェロシアン化カリウム（KFeCN6）で1時間後固定した。その後、水で2回洗浄し、マレイン酸緩衝液（MB）で1回洗浄した後、1%酢酸ウラニルを含むMB溶液で1時間インキュベートした。最後に水で2回洗浄し、段階的にアルコール溶液（50%、70%、90%、100%）で脱水した（各10分、2×10分）。
2. 次にサンプルをプロピレンオキシドに 1 時間浸漬し、プロピレンオキシドと TAAB Epon (TAAB Laboratories Equipment Ltd、https://taab.co.uk) の 1:1 混合物に一晩 (ON) 浸透させました。
3.翌日、サンプルをTAABエポンに包埋し、60℃で48時間重合させた。
4. Reichert UltracutS ミクロトームを使用して超薄切片（約 80 nm）を切り出し、銅グリッド上に集めてクエン酸鉛で染色しました。
材料
ベロ細胞
ATCC-CRL-1586 [2]
培地1
• イーグルス最小必須培地[4]
• 1x抗生物質・抗真菌剤
• 10%加熱不活化FBS
培地2
• イーグルス最小必須培地[4]
• 1x抗生物質・抗真菌剤
• 2%加熱不活化FBS
抗生物質・抗真菌剤
1倍抗生物質-抗真菌剤とは、増殖培地中の以下の最終濃度を指します：
•ペニシリン100 U/ml
•ストレプトマイシン0.1 mg/ml
•アムホテリシンB 0.25 µg/ml
サンプル固定液
細胞サンプルは、TEM ラボに送られる前に、以下の固定剤を使用して固定されました。0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4) 中の 2.5% グルタルアルデヒド、1.25% パラホルムアルデヒド、および 0.03% ピクリン酸。
参考文献
[1] Ammerman NC, Beier-Sexton M, Azad AF. Vero細胞株の増殖と維持. Current Protocols in Microbiology. 2008年11月; 付録4:付録4E. doi:10.1002/9780471729259 .mca04es11. PMID: 19016439; PMCID: PMC2657228.
[2] アメリカンタイプカルチャーコレクション、「VERO C1008 [Vero 76、クローンE6、Vero E6] 製品ページ」、https://www.atcc.org/products/crl-1586、2025年7月29日にアクセス。
[3] MilliporeSigma、「Vero C1008 [Vero 76、クローンE6、Vero E6] 製品ページ」、https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/sigma/cb_85020206、2025年7月29日にアクセス。
[4] アメリカンタイプカルチャーコレクション、「イーグルズ最小必須培地（EMEM）製品ページ」、https://www.atcc.org/products/30-2003、2025年7月29日にアクセス。
結果
PATH 1 (10%FBS/ネガティブコントロール)
1日目:
2日目:
3日目:
4日目:
5日目:
PATH 2 (2% FBS/テスト)
1日目:
2日目:
3日目:
4日目:
5日目:
CRO Labsによる細胞培養の説明
画像は、EVOS FL顕微鏡で明視野または位相差顕微鏡、10倍（400 µmスケール）または20倍対物レンズ（200 µmスケール）を使用して取得されます。
P1 0日目:
PREP_path1_passage 1_01から06
0日目（解凍後約1時間）に撮影したVero細胞の画像。個々の細胞、または少数の細胞からなる小さな塊が、まだ懸濁状態（接着していない状態）で画像中に均一に広がっている。細胞は明るく丸みを帯びており、生存していることを示す。この時点では、その他の形態学的特徴は観察されない。明視野。スケールバーは使用した対物レンズを示している。
P1 1日目:
PREP_path1_passage1_10-19
解凍1日後に撮影したVero細胞の画像。ほとんどの細胞は接着性で、上皮細胞に特徴的な玉石状の形態を呈している。細胞はよく広がり均一に分布しているように見えるが、細胞塊の間には顕著な隙間がある。個々の細胞は楕円形から多角形で、明瞭な核と核小体が観察される（20倍）。まだ丸みを帯びた細胞塊もいくつか見られる。細胞の境界は明瞭で、凝集、剥離、汚染の兆候は見られず、健全な増殖状態を示唆している。明視野顕微鏡観察。
PREP_path1_passage1_10: 合流性が低い領域
PREP_path1_passage1_17:合流性の高い領域
P1 2日目:
PREP_path1_passage1_201-219
解凍後2日目に撮影したVero細胞の画像。ほとんどの細胞は接着性で、上皮細胞に特徴的な玉石状の形態を呈している。細胞はよく広がり均一に分布しているように見えるが、細胞塊の間には顕著な隙間がある。個々の細胞は楕円形から多角形で、明瞭な核と核小体が観察される（20倍）。培養液全体に明るい丸みを帯びた分裂細胞が認められる。細胞の境界は明瞭で、凝集、剥離、汚染の兆候は見られず、健全な増殖状態を示唆している。明視野顕微鏡および位相差顕微鏡による観察。
PREP_path1_passage1_215: 視野全体に明るい分裂細胞が多数観察されています。画像中央には明るい丸い細胞の塊が見られます。画像全体に細胞が比較的均等に分布しており、小さな細胞塊または個々の細胞として観察されます。画像PREP_path1_passage1_216は、この視野の中央部を拡大した画像（20倍）です。位相差顕微鏡法による観察です。
P1 3日目:
PREP_path1_passage1_301-319:
解凍後3日目に撮影したVero細胞の画像。細胞はクラスターまたはシート状に増殖しており、接着性単層に典型的な放射状のパターンを呈している。培養は50～60%のコンフルエントで、ほとんどの細胞は大きな細胞島を形成しており、大きな細胞間隙間が見られることから、単層がまだ完成していないことが示唆されている。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、細胞膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明視野および位相差。
PREP_path1_passage1_303: 丸みを帯びた分裂細胞がいくつかあり、明るい反射点がいくつかあります。おそらく小さな破片ですが、汚染の明確な証拠はありません (例: 細菌または真菌の死骸)。
PREP_path1_passage1_317および318: 密集度の高い領域（約80～90%）
PREP_path1_passage1_319: 低集密度領域（約40%）。1時の方向にある1つの暗い点は、おそらくデブリです。7時の方向にある明るい細胞は分裂中です。
P1 4日目:
PREP_path1_passage1_401-413:
解凍後4日目に撮影したVero細胞の画像。細胞はシート状に増殖し、表面の大部分を覆っており、分裂細胞はほとんど見られない。細胞は典型的な多角形を呈し、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明視野および位相差。
PREP_path1_passage1_401 および 413: 分裂中の明るい細胞とまだ確認できる小さな隙間がある、高い合流性領域 (90% 以上)。この培養物を継代培養する必要があることを示しています。
PREP_path1_passage1_411: 下側の合流領域
PREP_path1_passage1_412: 画像の中央にある、細胞とは異なる領域にある大きな赤みがかった破片。
P2 1日目:
PREP_path1_passage2_101-113:
5日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は小さな塊となって増殖しており、接着性単層に典型的な放射状のパターンを呈している。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染は認められない。明視野、位相差。
PREP_path1_passage2_102:画像下部に、いくつかの有糸分裂像を伴う小さな接着細胞塊が見られます。12時の方向に、おそらく細胞破片と思われる小さな明るい反射点が見られます。
P2 2日目:
PREP_path1_passage2_201-216:
6日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は大きな塊となって増殖しており、接着性単層に典型的な放射状のパターンと、サブコンフルエントな培養を示唆する大きな細胞間隙が見られます。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部と明瞭な核が観察されます。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られません。スケールバーは使用した対物レンズを示しています。明らかな汚染の兆候はありません。位相差顕微鏡法。
PREP_path1_passage2_207: 下層の合流領域。分裂中の複数の明るい細胞。
PREP_path1_passage2_208:画像207の中央部分の拡大画像。中央上部: 核分裂（カリオキネシス）を経たが、細胞質分裂がまだ完了していない細胞。
PREP_path1_passage2_208: 細胞クラスターが大きい高集密度領域
PREP_path1_passage2_213:中央 - 有糸分裂中に観察された一対の明るい細胞
P2 3日目:
PREP_path1_passage2_301-312:
7日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は大きな塊となって増殖しており、接着性単層に典型的な放射状のパターンと、サブコンフルエントな培養を示唆する大きな細胞間隙が見られます。細胞は典型的な多角形または細長い形状を呈し、細胞質の突出部と明瞭な核が観察されます。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や汚染の兆候は見られません。スケールバーは使用した対物レンズを示しています。位相差顕微鏡。
PREP_path1_passage2_303: 中央左 - 有糸分裂中に観察された一対の明るい細胞
PREP_path1_passage2_305: 一部の細胞は、明瞭な大きな丸い透明な小胞状構造を持つ細胞質を有しています。2時と5時の方向に、明るい有糸分裂像がいくつか見られます。
P2 4日目:
PREP_path1_passage2_401-410:
8日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は大きな塊となって増殖し、細胞培養表面の大部分を覆い、放射状のパターンを呈している。細胞は典型的な多角形または細長い形状を呈し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や汚染の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。位相差顕微鏡。
PREP_path1_passage2_403 および 409: 細胞が密集している領域（約 90% の密集）。PREP_path1_passage2_404 および 410: それぞれ 403 および 409 の拡大画像。細胞間の隙間がほとんどないか全くないことがわかります。
PREP_path1_passage2_405: 合流性の低い領域 (合流性約 60%)。
P3 1日目:
PREP_path1_passage3_101-110:
9日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は小さな塊となって増殖しており、接着性単層に典型的な放射状のパターンを呈している。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡法。
PREP_path1_passage3_101:いくつかの有糸分裂像（1 時と 11 時）を示す小さな付着細胞クラスター。
PREP_path1_passage3_106:放射状の模様を持つ小さな細胞塊。複数の明るい細胞（おそらく分裂中）と、4時の方向に明瞭な有糸分裂像（2つの明確な核は核分裂が起こっているが細胞質が完全に分裂していないことを示唆しており、細胞質分裂が完了していないことを示唆している）が見られる。
P3 2日目:
PREP_path1_passage3_201-210:
10日目に撮影したVero細胞の画像。細胞はクラスター状に増殖しており、接着性単層に典型的な放射状のパターンを呈している。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部と明瞭な核が観察される。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡法。
PREP_path1_passage3_201:有糸分裂像を伴う細胞クラスターの結合（11時方向）。PREP_path1_passage3_202 :複数の分裂細胞を示す前画像（左上）の拡大図。
PREP_path1_passage3_209:細胞のない領域に囲まれた小さな細胞クラスターがある、合流性の低い領域。
P3 3日目:
PREP_path1_passage3_301-310:
11日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は大きな塊となって増殖しており、接着性単層に典型的な放射状のパターンを呈している。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡法。
PREP_path1_passage3_301:細胞クラスターと無細胞領域を結合し、培養が合流していないことを示しています。
PREP_path1_passage3_302:表面を覆う大きな細胞群。1と7に分裂中の細胞（明るい細胞）がいくつかある。
PREP_path1_passage3_303および304：高集密度領域。細胞はシート状に増殖し、表面積の大部分を覆っています。
PREP_path1_passage3_307:合流性の低い領域。
P3 4日目:
PREP_path1_passage3_401-410:
12日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は大きな塊となって増殖しており、表面の大部分を覆う接着性単層に典型的な放射状のパターンは、培養が継代培養の準備ができていることを示しています。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部と明瞭な核が観察されます。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られません。スケールバーは使用した対物レンズを示しています。明らかな汚染の兆候はありません。位相差顕微鏡。
PREP_path1_passage3_401:細胞は大きなシート状または細胞塊状に増殖しています。細胞のない領域がまだ存在しており、培養がコンフルエントではないことを示しています。明るい（分裂中の）細胞はごくわずかです。PREP_path1_passage3_402 : 401画像の左下部分の拡大図。
実験P4 1日目:
EXP_path1_passage4_101-110:
13日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は小さな塊を形成し、放射状のパターンを呈している。複数の単独細胞と、分裂中の丸い細胞が混在している。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を呈し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡による。
EXP_path1_passage4_101:ほとんどの細胞は接着性で、小さな塊となって増殖しています。視野全体に複数の明るい細胞が見られます。
EXP_path1_passage4_103: 10個未満の細胞からなるクラスターが均一に領域を覆う低集密度領域と、画像の左上に有糸分裂像を示す複数の明るい細胞。EXP_path1_passage4_104 : 103の拡大図。3時の位置に有糸分裂像。
EXP_path2_passage4_101-110:
13 日目に撮影された Vero 細胞の画像。細胞はさまざまな形態を示していますが、ほとんどは、ある程度の広がりを伴う細長い形または紡錘形をしており、線維芽細胞様細胞または間葉系細胞の特徴です。いくつかの細胞は丸みを帯びており、これは有糸分裂活動、接着不良、またはストレスの初期兆候を示している可能性があります。全体的な密集度は低く、おそらく 20～30% 程度です。これは、培養がまだ成長初期段階にあり、拡大する余地が十分にあることを意味します。細胞は視野全体に均等に分布しており、時折小さなクラスターが見られます。細胞は健康に見え、膜は損傷されておらず、基質への接着が良好で、剥離や細胞質顆粒化の明らかな兆候はありません。スケールバーは使用した対物レンズを示しています。明らかな汚染の証拠はありません。位相差顕微鏡。
EXP_path2_passage4_101:少数の小さなクラスターが認められる。ほとんどの細胞は細長い形または紡錘形で、ある程度の広がりを呈している。複数の細胞は丸みを帯びており、一部は有糸分裂中である（中央）。
実験P4 2日目:
EXP_path1_passage4_201-210:
14日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は小さな塊を形成し、放射状のパターンを呈している。複数の単独細胞と、分裂中の丸い細胞が混在している。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡による。
EXP_path1_passage4_201:ほとんどの細胞は接着しており、小さな塊となって増殖しています。分裂中の細胞：画像中央と12時の方向。
EXP_path1_passage4_202 : 101の画像中央を拡大したもの。視野中央に分裂中の細胞が見られます。
EXP_path2_passage4_201-210:
14日目に撮影されたVero細胞の画像。細胞は多様な形態を示すが、大部分は線維芽細胞様細胞または間葉系細胞の特徴である、ある程度の広がりを持つ細長いまたは紡錘形を呈する。少数の細胞は丸みを帯びており、これは有糸分裂活動、接着不良、あるいはストレスの初期兆候を示している可能性がある。全体的な細胞密度は低い。細胞は視野全体に均一に分布しており、時折小さな塊が見られる。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の証拠は見られない。位相差顕微鏡。
EXP_path2_passage4_201:少数の小さな細胞塊（10個未満の細胞）が認められる。複数の単一細胞がある程度拡散している。EXP_path2_passage4_202 : 201画像中央の拡大図。小さな細胞塊が認められる。細胞は小さく、細胞質は緻密である。複数の細胞は丸みを帯びている。一部の細胞には明るい反射点が認められる。
実験P4 3日目:
EXP_path1_passage4_301-310:
15日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は放射状のパターンを呈し、クラスターを形成している。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染は認められない。位相差顕微鏡法。
EXP_path1_passage4_305:細胞は付着しており、融合し始めているクラスターで成長しています。
EXP_path2_passage4_301-310、301a-310a:
15日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は多様な形態を示している。丸みを帯びた細胞は少なく、突出している細胞もいくつかあり、接着が維持されていることがわかる。全体的な集密度は低く、複数の小さなクラスターと多数の単一細胞が認められる。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着も良好で、明らかな剥離の兆候は見られない。細胞質は緻密/顆粒状に見える。明るい反射点がいくつかあり、大きな液胞のように見えるものもあれば、細胞片のように見えるものもある。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡。
EXP_path2_passage4_303:いくつかの小さな塊が見られ、明るい点（液胞）がいくつか見られます。7時の方向に分裂細胞が2つあります。複数の単一細胞がある程度広がり、丸みを帯びています。
EXP_path2_passage4_307および308:集密度が低い領域と非常に小さなクラスター。視野内に複数の単一細胞が均等に広がり、中には細胞質が拡張しているものもある。
実験P4 4日目:
EXP_path1_passage4_401-410:
16日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は大きな凝集塊を形成し、放射状のパターンを呈している。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出部が明瞭に観察され、核は明瞭に定義されている。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られない。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡法。
EXP_path1_passage4_401:細胞は接着しており、融合し始めているクラスター状に増殖しています。明るい分裂細胞はごくわずかです。視野の左下隅近くに有糸分裂像が見られます。
EXP_path1_passage4_406:細胞が融合し始め、表面の約50%を覆う大きな塊。一部の細胞は明るい小胞を形成している。
EXP_path2_passage4_401-410:
16日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は多様な形態を示している。丸みを帯びた細胞は少なく、突出している細胞もいくつかあり、接着が維持されていることがわかる。全体的なコンフルエンシーは低く、複数の小さなクラスターと多数の単一細胞が認められる。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着も良好で、明らかな剥離の兆候は見られない。細胞質は緻密/顆粒状である。明るい反射点がいくつかあり、大きな液胞のように見えるものもあれば、細胞片のように見えるものもある。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡による。
EXP_path2_passage4_402:いくつかの小さな塊が見られ、明るい点（液胞）がいくつか見られます。7時の方向に分裂細胞が2つあります。ある程度広がった複数の単一細胞があります。複数の丸い細胞があります。一部の細胞は丸みを帯び、屈折しており、死にかけている細胞を示唆している可能性があります（6時の方向）。
EXP_path2_passage4_405, 406:低集密度領域には、ごく小さな細胞塊がいくつか存在する。視野内には複数の単一細胞が均一に広がり、中には細胞質が突出しているものもある。一部の円形細胞は顆粒状で不規則な形状をしており、死滅細胞または細胞片である可能性が高い。
実験P4 5日目:
EXP_path1_passage4_501-510:
17日目に撮影したVero細胞の画像。大きな融合細胞群または放射状パターンを示す細胞が見られ、明るい分裂細胞は少数です。細胞は典型的な多角形または細長い線維芽細胞様の形状を示し、細胞質の突出が目立ち、核は明瞭です。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着は良好で、明らかな剥離や細胞質顆粒化の兆候は見られません。スケールバーは使用した対物レンズを示しています。明らかな汚染の兆候はありません。位相差顕微鏡による観察。
EXP_path1_passage4_501:細胞は接着しており、大きな合体したクラスターを形成して増殖しています。視野全体に細胞が存在しない領域があり、培養がコンフルエントに達していないことを示しています。
EXP_path2_passage4_501-510:
17日目に撮影したVero細胞の画像。細胞は多様な形態を示している。丸みを帯びた細胞は少なく、突出している細胞もいくつかあり、接着が維持されていることがわかる。全体的なコンフルエンシーは低く、複数の小さなクラスターと多数の単一細胞が認められる。細胞は健全に見え、膜は損なわれておらず、基質への接着も良好で、明らかな剥離の兆候は見られない。細胞質は緻密/顆粒状である。明るい反射点がいくつかあり、大きな液胞のように見えるものもあれば、細胞片のように見えるものもある。スケールバーは使用した対物レンズを示している。明らかな汚染の兆候は見られない。位相差顕微鏡による。
EXP_path2_passage4_503 & 504:単一細胞から様々なサイズの細胞塊まで、様々な形状の細胞が成長面を均一に覆っています。液胞と思われる明るい反射点がいくつか見られます。培養液はストレスの兆候を示しており、顆粒状の細胞質、死滅または細胞破片と思われる明るい浮遊細胞（中央の画像）、そして3時の方向に不規則な形状の細胞が見られます。
EXP_path2_passage4_507, 508:低集密度領域には、ごく小さな細胞塊がいくつか存在する。視野内には複数の単一細胞が均一に広がり、中には細胞質が突出しているものもある。一部の円形細胞は顆粒状で不規則な形状をしており、死滅細胞または細胞片である可能性が高い。
分析と解釈
ここでは、標準的なウイルス感染症の細胞に見られる、特異的であると主張される細胞変性効果の形態とその説明を概説します。それぞれの形態について、公表されているウイルス感染症の画像例に加え、実験プレートの画像と、それらを実施した契約研究技術者による説明を示します。画像がある場合は、出典となった出版物へのリンクが貼られています。
1. 四捨五入
出版された参考文献
答え:
B.
実験
CROの説明:
2. シンシチア
出版された参考文献
実験
3. 空胞形成
出版された参考文献
答え:
バ：
実験
CROの説明
4. バルーン化と腫れ
出版された参考文献
実験
5. 単層の剥離
出版された参考文献
実験
CROの説明
6. フォーメーションプレート
出版された参考文献
実験
CROの説明
7. 細胞質封入体
出版された参考文献
実験
CROの説明
8 & 9 壊死とアポトーシス
出版された参考文献
実験
CROの説明
結論
細胞培養におけるウイルス分離のプロトコルを概説するための合意された参考資料は、臨床検査標準協会 (CLSI) の M41 というタイトルの参考マニュアルで定義されています。
このCLSIガイドラインは、臨床ウイルス学研究室において市販の細胞培養物および試薬を用いたウイルス培養および同定のための重要なガイダンスを提供します。細胞培養物の選択、維持、品質管理、検体調製、分離株の同定、結果の解釈など、信頼性の高いウイルス培養に不可欠な要素を概説しています。
このリファレンス マニュアルでは、すべての感染培地で FBS 濃度を 10% 成長培地よりもずっと低く、推奨される 1 ～ 3% FBS まで下げるべきであると明確に指示されています。
ここで、アメリカ微生物学会は、培養後 5 日間経過する前に培養物中に観察される CPE の形態は、ウイルスの存在を示す閾値を満たすのに十分であると述べています。
ここで AI は、細胞培養がウイルスに感染しているかどうかを判断する基準の閾値は単一の CPE 形態が確認されることであるというアメリカ微生物学会の見解に同意しています。
実験を実施した独立研究機関は、本研究の目的を知らず、細胞培養プロトコルは細胞株を飢餓状態にすることで細胞外小胞（CPE）を生成させ、透過型電子顕微鏡で観察することだと説明を受けていました。研究目的を知らされていなかったにもかかわらず、彼らは培養物の説明において、ウイルスの存在を示唆するとされるCPEの形態9つのうち6つを確認しました。
検査技師が培養において明確に指摘しなかったCPEの形態は、シンチシアやプラーク形成といった、複数の細胞のより広範な形態形成に関係していました。これらの形態は培養中に存在していましたが、広く見られるものではなく、HEK細胞株を用いた最初の研究で観察された形態とは全く異なっていました。
最初の研究では、培養1日目のコンフルエンスは～90%で、まだ成長を許すポケットがあり、DMEMは赤色のままであったことから、細胞が過密状態によって飢餓状態に陥っていないことが示されました。対照的に、本研究では両方のパスが～30%の低いコンフルエンスで開始され、成長培地パス1は最終的に～80%のコンフルエンスで成長しました。低FBSパス2では、細胞株の停滞とアポトーシスが見られ、CROによると5日目に～15%の低いコンフルエンスで終了しました。最初の研究のようにコンフルエンスがより高い割合で開始されていた場合、最初の研究で見られたようなシンクチアやプラーク形成などのより広範なCPE形態につながっていた可能性が高いと思われます。
臨床検査基準協会（Clinical & Laboratory Standards Institute）は、感染時にFBS濃度を下げること、およびウイルスの存在の閾値としてCPEの形態変化が観察されることを明確に指示しています。本研究の結果は、当初の知見を裏付けるものであり、この血清濃度の低下が、CPEおよび培養中のウイルスの存在の原因であることを明確に示しています。
これらの包括的な研究から、ウイルス分離のゴールド スタンダードは有効な方法ではなく、ゴールド スタンダードとして基準となる精製または分離された個別の生物学的粒子が生成されていないことを考えると、ウイルスの存在を示すために使用される下流の生化学アッセイが無効になることが明らかです。
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＜転載終了＞
しました
要するに、医療界も含めてあちこちで 既存（権力）集団 について
都合の悪い情報が出て来ると、それにｽﾄｯﾌﾟをかける動きが必ず出て
くるという事ですね。
政治の世界ではすでにめまぐるしい情報の流し方が見られています
から、話題が「ｳｲﾙｽ」であっても、これは何ら不思議ではありません。
長い間「嘘」情報を流していた者達が今後どれほど工夫をして
も、状況は後戻りしないはずです。 その場では一時的に「嘘」情報が
影響するかもしれないが、今の「情報社会・ｼｽﾃﾑ」では嘘を長期間
隠しておくことは出来ない。
また、嘘の情報を流す者達の「意図」を私達は見抜くようになった。
「知った後」 の状態を 「知る以前」 の状態に戻すことは出来ない
のですね、どうやっても。
ザンネンでした。
genkimaru1
が
しました